抗除草剂转基因技术引入植物保护领域后，由于具有诸多优点而迅速发展(苏少泉, 2002)，抗除草剂作物的研发也是作物基因工程中最活跃的领域(孙丙耀等, 2002)。在植物转基因研究过程中，通常采用选择性标记基因提高转化筛选效率，而草铵膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene, bar)是玉米转基因研究中常用的筛选标记基因。草铵膦可以强烈抑制植株内的谷氨酰胺合成酶的活性，导致细胞内氨的迅速积累，随叶绿体结构解体，最后整个植株中毒死亡(Thompson et al., 1987)。目前，国际上抗除草剂转基因玉米已产业化，并大面积种植。国内抗除草剂转基因玉米的研究也取得很大成功(梁雪莲等, 2001; 段发平等, 2001; 张宏军等, 2002; 2004; 刘小红, 2007)。

在转基因研究和安全评价等过程中对转基因植株的鉴定是必不可少的环节。传统上初步鉴定转基因的方法是利用聚合酶链反应(PCR)鉴定目的基因DNA片段是否存在。但是PCR方法步骤繁琐，做大量鉴定运用时有一定的局限性。利用筛选标记基因的农艺性状，建立快速有效的非生物鉴定方法非常必要。本研究以含草铵膦选择标记的转基因玉米为研究材料，通过叶片喷雾、叶片离体培养方法建立抗除草剂转基因玉米快速的鉴定方法，并探索出可以有效区分转化和非转化植株的筛选剂浓度。本研究建立的两种检测方法，既可以用于转基因植株当代的检测筛选，又可以用于转基因后代植株的大规模检测，大大减少转基因后代培养和进一步鉴定的工作量。

1结果与分析
1.1叶片喷洒除草剂法鉴定转基因植株
植物叶片喷洒除草剂后，野生型植物叶片会发生枯萎，而抗除草剂转基因植物则正常生长。因此，该方法可用于鉴定含抗除草剂基因的转基因植株。

含bar基因的两种转基因玉米丹340 PTF和Pa91 PTF对草铵膦具有抗性。草铵膦喷洒的浓度梯度试验结果表明，草铵膦喷洒玉米丹340和Pa91叶片可在较短的时间内显著地区分玉米植株是否含有bar基因。喷洒草铵膦8~10 d之后，野生型玉米叶片逐渐变黄枯萎，有明显中毒症状，当草铵膦浓度大于2 000 mg/L时，野生型植株全部死亡，而转bar基因的玉米丹340 PTF和Pa91 PTF叶片没有黄化症状，生长正常(图1)。表明用该浓度的草铵膦溶液喷洒玉米叶片，即可准确、有效地区分转基因与非转基因玉米植株。并且bar转基因玉米在高浓度草铵膦下依然生长正常，表现出对草铵膦的良好抗性。

图1 叶片喷洒草铵膦浓度试验 Figure 1 Leaf-painting of Glufosinate

1.2叶片离体培养法鉴定转基因植株
用含草铵膦的水溶液浸泡植株叶片，可简便地鉴定转基因植株。但由于植株叶片有较大的表面张力，影响了筛选剂与叶片的接触。而在琼脂培养基上，叶片可以完全接触含有筛选剂的培养基。因此，本研究配置了含草铵膦的琼脂培养基用于叶片抗性筛选剂的鉴定。由于培养基中不含糖分，可有效地避免离体叶片上滋生细菌和真菌。为了保持叶片的鲜绿，本研究还在培养基中加入了1 mg/L的6-BA。本文确定了叶片离体培养法中草铵膦和草甘膦筛选剂的使用浓度。

随着草铵膦浓度的增加野生型植株叶片逐渐呈现褐色条带，叶片表面出现褐斑，当培养基中草铵膦浓度大于5 mg/L时，野生型叶片全部褐化，而转基因材料中植株叶片没有明显的褐化症状，并始终保持鲜绿色(图2)。因此，含有5 mg/L草铵膦的固体培养平板即可快速鉴定玉米植株是否携带bar基因。

图2 离体叶片平板培养法草铵膦浓度试验 注: a: Pa91 CK; b: Pa91 PTF; c: 丹340 CK; d: 丹340 PTF Figure 2 Leaf-incubation on the solid medium with Glufosinate Note: a: Pa91 CK; b: Pa91 PTF; c: Dan 340 CK; d: Dan 340 PTF

1.3转基因植株分子检测
使用试纸条检测方法对玉米Pa91和丹340叶片进行检测，Pa91 PTF和丹340 PTF两种转基因植株叶片试纸条检测均为阳性，Pa91 CK和丹340 CK两种非转基因植株叶片试纸条检测均为阴性(图3)。

图3 Bar试纸条检测方法 注: a: Pa91 CK; b: Pa91 PTF; c: 丹340 CK; d: 丹340 PTF; e: 检测线; f: 对照线 Figure 3 Quick stix strips for Liberty link (Bar) Note: a: Pa91 CK; b: Pa91 PTF; c: Dan 340 CK; d: Dan 340 PTF; e: Test line; f: Control line

2讨论
随着转基因玉米种植面积的日益扩大，建立了标准的转基因检测方法十分必要， 通常采取基因水平检测和蛋白水平检测(吕山花等, 2002)，但是都费时费力，在大规模、快速检测时有一定局限性。本研究以抗除草剂转基因玉米为研究材料，建立了叶片喷雾法和叶片离体培养法两种快速的鉴定抗除草剂转基因玉米方法。与传统的分子检测方法相比，这两种方法方便易行、成本低、误差小，可明显地减少转基因植株后续检测的工作量，在植物转基因领域及转基因安全检测工作中具有很好的应用前景。

叶片喷雾法及离体叶片培养法既可以用于转基因植株当代的检测，又可以用于转基因植株后代的检测。草铵膦药效迅速，土壤中可快速降解，不仅广泛应用于农业生产，同时在植物转基因研究中也十分重要(Su, 2005a; 2005b)。采用合适浓度直接喷雾或者叶片离体培养可以有效区分转化和非转化植株。玉米叶片喷雾采用2 000 mg/L草铵膦可以达到有效区分是否为抗除草剂转基因玉米。由于除草剂的来源和不同作物叶片对草铵膦的吸收不同，采用叶片喷雾法检测抗除草剂转基因水稻和大豆时分别需要300 mg/L和135 mg/L草铵膦(马林等, 2012)。借鉴离体叶片鉴定转基因植物水稻的经验(刘巧泉等, 2001)，培养基中含有5 mg/L草铵膦可有效区分是否为抗除草剂转基因玉米。这些不仅说明叶片喷雾法及叶片离体培养法可有效的鉴定转基因材料，也说明bar基因在玉米中表达后的确能够提高玉米对草铵膦的抗性。对采用这两种检测方法获得转基因植株采用Bar试纸条检测证明后100%吻合。

本研究表明转基因植株经过适宜的筛选压力，可有效地区分转基因阳性植株和假阳性植株，而且方法非常简单，结果可靠，特别适合于转基因后代植株的大规模筛选。当然，简单的筛选剂筛选方法也有不足之处，较老的叶片对筛选剂反应不灵敏，易造成误判，应尽量选取幼嫩叶片进行试验。另外，在实际应用中，还应根据基因来源以及植物材料对筛选剂的反应水平探索适合的浓度。总之，本研究建立的检测方法还是能够快速、有效、经济的初步筛除非转基因材料，减少后续精确鉴定的工作量，尤其在大规模的检测中具有一定实用价值。

3材料和方法
3.1材料
3.1.1植物材料 
本研究所用的植株材料列于表1。

表1 植物材料及来源 Table 1 Plant materials and description

3.1.2试剂
草铵膦(Glufosinate)除草剂BASTA由拜耳公司生产；6-苄氨基嘌呤(6-BA)是由Sigma公司购入；国产琼脂(Agar)由上海鼎国生物技术有限公司提供；Bar试纸条购于美国EnviroLogix公司。

3.2方法
3.2.1叶片喷雾法筛选转基因植株
实验中将不同浓度的草铵膦溶液(0, 1 000 mg/L, 2 000 mg/L, 3 000 mg/L和4 000 mg/L)均匀喷洒在4叶期转基因玉米和对照材料的叶片表面，直到叶片滴水，8~10 d后观察。

3.2.2叶片离体培养法筛选转基因植株
先将只含0.7%琼脂的蒸馏水煮沸使琼脂溶解，冷却至55℃时加6-苄氨基嘌呤(6-BA) (终浓度1 mg/L)和草铵膦(终浓度分别为0, 1 mg/L, 2 mg/L, 3 mg/L, 4 mg/L, 5 mg/L, 6 mg/L, 7 mg/L, 8 mg/L和9 mg/L)混匀，制成固体培养平板。剪取4叶期新长出5 d左右的新鲜绿色叶片(两端均留有切口)，长度为1 cm左右，平贴于培养基上，25℃，16 h光照/8 h黑暗培养2 d后观察。

3.2.3转基因植株分子检测
Bar试纸条快速检测法：取稍许长度1 cm左右叶片放入1.5 mL的离心管中，用研磨棒将叶片研碎，加入0.5 mL提取液，搅拌均匀，将试纸条按规定的方向插入混合液中，5 min后观察结果。若试纸条出现2条带就表明该植株是阳性植株，若出现1条带说明是阴性植株，如果没有带表明操作有误(卢涛等, 2011)。

作者贡献
郭嘉是本研究的实验设计和实验研究的执行人，撰写并修改论文；郭嘉和孙传波完成数据分析；姜志磊、孟凡梅和曲文利参与试验结果数据分析；袁英是项目的构思者和负责人，指导实验设计，数据分析，论文修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由2012年吉林省财政厅育种项目资助。感谢吉林省农业科学院农业生物技术研究所刘德璞在本研究过程中提供的帮助。

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